RNA實驗和方案新手必讀（三）

起始材料的有效破碎和勻漿對于所有總RNA分離操作來說都是必須的要求。破碎和勻漿是兩個獨立分開的步驟。

• 破碎：對于組織結構、細胞壁和細胞質(zhì)膜的徹底破碎對于釋放樣本中所有的RNA是必要的。不同樣本需要使用不同的方法以達到徹底的破碎效果。不完全的破碎會導致RNA得率的顯著降低。
• 勻漿：勻漿對于減少破碎后細胞裂解產(chǎn)物的粘性是十分必要的。勻漿能夠切斷高分子量的基因組DNA及其他高分子量的細胞組分，得到均勻的裂解產(chǎn)物。勻漿不夠徹底會導致RNA結合效率的下降而顯著降低得率。

某些破碎方法能夠同時對樣本起到勻漿作用，而其他方法還是需要專門的勻漿步驟。表針對不同樣本進行破碎和勻漿的準則**概述了適用于多種起始材料的不同破碎和勻漿方法。當您針對所使用的起始材料選擇合適的操作方法時，該表格可用來作為參考。下面也將針對破碎和勻漿方法進行更為詳細的論述。

使用玻珠研磨機進行破碎和勻漿

在使用玻珠研磨機破碎樣本的過程中，樣本與珠子被一起進行高速攪拌。通過珠子與細胞碰撞時的流體動力切割和破碎作用，同步完成破碎和勻漿過程。破碎效率的影響因素有：

• 珠子的大小和組成
• 緩沖液與珠子的比例
• 起始樣本的數(shù)量
• 攪拌速度和設定
• 處理時間

**破碎時所使用的理想珠型為0.1毫米（平均直徑）的玻璃珠，用于酵母和單細胞動物細胞時為0.5毫米的玻璃珠，對動植物組織則應使用3–7毫米的不銹鋼珠。請確保玻璃珠經(jīng)過濃硝酸的預先潤洗?；蛘呖芍苯淤徺I和使用市售的經(jīng)酸洗滌過的玻璃珠。關于破碎的其他參數(shù)需要依據(jù)每一應用的經(jīng)驗進行設定。植物材料以及相關的珠子和破碎管可先在液氮中預冷，破碎應在無裂解緩沖液的條件下進行。對于動物組織則應使用干燥的冷凍粉碎。冷凍粉碎（無論是在玻珠研磨機中還是使用研缽和杵）不同于緩沖液裂解，不會對樣本同時起到勻漿作用。

使用轉子——定子勻漿器進行破碎和勻漿

在裂解緩沖液的存在下，轉子–定子勻漿機可同時完成對動物組織的徹底破碎和勻漿，所需時間基于樣本的堅韌程度，可在5–90秒內(nèi)完成。轉子–定子勻漿機也可以用于細胞裂解產(chǎn)物的勻漿。轉子的超高速旋轉能夠以擾動和機械剪切的綜合方式，完成對樣本的破碎和勻漿。使用適當大小的管子，在勻漿過程中始終保證勻漿器頭部一直處于浸沒狀態(tài)，并持續(xù)將勻漿器頭部伸入管子末端，以確保勻漿過程中樣本內(nèi)的泡沫達到少。轉子–定子勻漿機有不同大小型號可供選擇，并可裝配不同大小的探頭。5 mm和7 mm的探頭適合在300 μl以下的體積內(nèi)使用，并可用于離心管內(nèi)的勻漿。10 mm及以上尺寸的探頭則適用于更大的管子。

使用研缽和杵破碎

使用研缽和杵破碎時，先將樣本進行迅速的液氮冷凍，并在液氮中將其研磨為細粉。將上清液（組織粉末和液氮）轉移至液氮預冷的適當大小的管中，使液氮揮發(fā)但不要讓樣品融解。加入裂解緩沖液，并盡可能快地進行后續(xù)步驟。

注：使用研缽和杵研磨樣品會破碎樣品，但無法達到勻漿的目的。勻漿作用需與此步驟分開進行。

使用注射器和針頭完成勻漿

細胞和組織的裂解產(chǎn)物可以使用注射器和針頭進行勻漿?？梢允褂?0號（0.9 mm）針頭連接一個**塑料注射器，通過至少5–10次的吹打切斷高分子量的DNA，直至裂解產(chǎn)物的勻漿形成。為操作便利和減少樣品損失，也可能需要增加裂解緩沖液的體積。

一些樣本來源在其RNA或內(nèi)含物方面存在著顯著不同，可能導致RNA的分離和分析過程出現(xiàn)問題。當操作這些樣本來源時需要一些特別注意事項。本節(jié)將針對大量不同樣本來源的操作進行探討。

植物

從植物材料中分離RNA會遇到一些特殊困難，常規(guī)技術在用于植物樣本之前一般要先經(jīng)過條件優(yōu)化。一些植物代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)與核酸相似，導致其難于從RNA制備產(chǎn)物中除去。（使用不當?shù)模┘兓椒ǎㄈ琨}類或苯酚）所導致的代謝物（例如多糖類、多酚類和黃酮類）或污染物與目的RNA的共分離，可能造成對酶促反應的抑制，或?qū)е伦贤夥止夤舛葴y定和凝膠電泳結果上的偏差。從植物材料中分離RNA的過程中可能遇到的困難還包括由于較高粘性導致的吸取體積錯誤，以及儲存過程中的RNA降解問題。

通常對植物的生長條件進行優(yōu)化，使其不產(chǎn)生高水平的植物代謝產(chǎn)物，可有助于對RNA的有效分離。由于植物種類之間存在較大差異，因此對其生長條件很難有同一的指導標準。不過作為普適原則，建議盡可能使用健康幼嫩的植物組織。年輕植物組織的RNA得率通常高于年老組織，因為前者在等重條件下通常比后者包含更多的細胞。而且等重的年輕組織通常也包含更少的代謝物。此外，許多“自定義”的RNA分離方法都推薦將植物組織在黑暗中培養(yǎng)1–2天后再進行收獲，以避免形成植物代謝物的高水平積累。

心臟、肌肉和皮膚組織

從例如骨骼肌、心臟和皮膚組織一類的樣本中分離RNA可能比較困難，因為此類樣品中含有大量的收縮性蛋白、結締組織和膠原。為了去除這些可能對RNA分離造成干擾的蛋白，需要使用蛋白酶或含苯酚的裂解試劑對此類樣本進行處理。不過，蛋白酶的消化過程需要避免RNA發(fā)生降解。

**

**mRNA的很多基本特征都不同于真核生物的mRNA。原核生物的mRNA沒有5’帽子，也很少具有poly A尾。缺少poly A尾的mRNA無法通過雜交進行捕獲。另外，也無法在合成初始鏈的過程中使用寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷（oligo–dT）引物，只能使用隨機引物作為替代。

此外，**RNA也十分地不穩(wěn)定，快速生長的品種中RNA的平均半衰期約為3分鐘。某些**的mRNA在翻譯同時即發(fā)生降解。因此對于嘗試從**中分離mRNA的研究人員來說，這可算是一個**煩。也由于**中的mRNA的周轉（從生成到降解）非?？?，造成原核生物的基因表達研究比真核生物更為困難。為了地保留基因表達譜，并使完好mRNA的得率大化，在樣本獲取和加工之前需要對其進行穩(wěn)定處理。

血液

血液直接源于臨床分析的收集樣本。在收集管中使用RNA穩(wěn)定處理試劑可成功保存血液樣本的RNA。從血液中分離RNA的方法，需要能夠確保生成無污染物或酶抑制劑的高質(zhì)量RNA。血液中所含有的大量酶抑制劑會對下游的RNA分析造成干擾。此外，如肝素和EDTA等一類常規(guī)的抗凝血劑也會干擾下游分析。應注意抗凝血劑并不會對RNA起到穩(wěn)定化作用。

人類血液中的紅血球（血紅細胞）不含細胞核，因此不會合成RNA；通常情況下這類細胞僅含有非常微量的RNA，而不是RNA分離的主要對象。從全血中分離RNA的主要靶標細胞為白血球（白細胞），這類細胞含有細胞核和RNA。白血球由三種主要的細胞類型構成：**細胞、單核細胞和粒細胞。

由于健康的血液中所含的紅細胞數(shù)量約為白細胞的1000倍，去除紅細胞會有助于簡化RNA分離步驟?？赏ㄟ^選擇性地裂解紅細胞來達到此目的，因為紅細胞對低滲休克更為敏感（相比白血球），在低滲緩沖液中會迅速發(fā)生破裂。

裂解紅細胞的另一種常見替代方法是Ficoll密度——梯度離心法。與紅血球裂解法不同，F(xiàn)icoll密度——梯度離心法僅獲取單核的細胞（**細胞和單核細胞），而會去除粒細胞。經(jīng)Ficoll密度––梯度離心法分離出的單核細胞能夠使用與其他動物細胞一樣的方法進行RNA分離。

FFPE組織樣品

福爾馬林固定，石蠟包埋(FFPE)的組織樣本是生物醫(yī)學研究中的重要和廣泛的樣本來源。越來越多的研究者開始針對FFPE樣本開始分子水平的分析，因此考慮這些樣本的獨特屬性以發(fā)展針對性的分離方法變得越來越重要。

由于在固定和包埋過程中使用了甲醛，通常會使FFPE樣本中的核酸發(fā)生嚴重的片段化和化學改變。因此，從FFPE樣本中分離到的核酸會比新鮮樣本或冰凍樣本的分子量更低。其片段化程度基于樣本類型、保存期長短，以及固定、包埋和儲存的條件而發(fā)生變化。盡管在凝膠電泳或芯片實驗室（lab–on–a–chip）分析等標準質(zhì)量控制分析中無法測得甲醛修飾情況，但后者實際會對酶學分析造成嚴重干擾。

為了將FFPE儲存法對RNA轉錄物的影響降至低，應牢記下列小貼士：

• 盡可能快地取樣和固定組織
• 不要使用厚度超過5 mm的樣本，樣本固定時間不宜過長（長24小時）
• 使用的試劑進行石蠟包埋，不要加入其它添加劑
• 盡可能避免對樣本進行染色
• 適當?shù)貎Υ鍲FPE樣本（RNA在4°C可完好保存至1年，優(yōu)于保存在室溫或更高溫度）
• 使用適當?shù)拿撌灢襟E
• RNA分離應包含一個解交聯(lián)的步驟

純RNA可以儲存在–20°C或–70°C的不含RNase的水中。在上述條件下，1年內(nèi)都不會發(fā)生RNA降解。

以上信息來源于QIAGEN官網(wǎng)：